富血小板血漿在骨科領(lǐng)域的應(yīng)用
日期：2013-08-29
富血小板血漿( plate let rich plasma, PRP) 是自體全血經(jīng)過梯度離心、分離得到的血小板濃縮物, 血小板含量豐富。當(dāng)血小板激活時, 能釋放多種生長因子,它們在促進骨細胞和成骨細胞的增殖、生長、分化和組織的形成過程中起著重要的作用[1]。自1998年Marx等[2]首次用PRP復(fù)合移植骨修復(fù)下頜骨缺損以來，PRP已逐漸應(yīng)用于口腔、整形、骨科、耳鼻喉科、神經(jīng)外科等領(lǐng)域的組織修復(fù)中。本文現(xiàn)就PRP的分離、制備和其在骨科領(lǐng)域的應(yīng)用以及存在問題進行綜述, 并對其應(yīng)用前景作一展望。皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院創(chuàng)傷骨科楊民
1 PRP的分離和制備
PRP是根據(jù)血液中各組成成分沉降系數(shù)不同，通過密度梯度離心法將PRP從全血中分離出來的PLT濃縮物，但目前尚無統(tǒng)一的制備方法[3]。 不同離心次數(shù)、離心力、離心時間以及PLT不同的激活方式所制備的PRP中，PLT數(shù)量、各種生長因子濃度、白細胞數(shù)量各不相同[4];且各種手術(shù)方式以及應(yīng)用PRP的時間亦產(chǎn)生不同的生物效應(yīng)，因此產(chǎn)生了對PRP生物效應(yīng)的分歧[5]。根據(jù)不同生理病理需要，制備不同生長因子含量的PRP是未來研究的方向。
PRP的制備方法大體可分為手工制備和全自動制備兩種。手工制備過程較繁瑣，但所需設(shè)備簡單，易于開展。全自動制備需要特殊設(shè)備，目前常用設(shè)備有SmartPReP 系統(tǒng)、Trissee 系統(tǒng)、Platele concentrate collection系統(tǒng)、Curasau 系統(tǒng)等。手工操作分離法與全自動血小板分離機分離法在離心后，血小板數(shù)量無明顯差異，雖然全自動血小板分離機操作簡便，自動化程度高，制備得到的PRP血小板純度和濃度均高，但此方法一般用于用血量較多(一般在150ml以上)或需建立靜脈循環(huán)通道，目前主要用于血庫血小板的采集以進行成分輸血，因其成本較高，限制了其在臨床的廣泛應(yīng)用。但無論是何種制作方法，其制備原理均相似，即根據(jù)血液中各組分的沉降系數(shù)進行分層制備。1次離心后血液可分為3 層，最底層是沉降系數(shù)最大的紅細胞，最上層是上清液，交界處有一薄層，即富血小板層。一次離心后棄去上清液或紅細胞層，然后改變離心力再次離心，可分離更多血小板。兩次離心法仍是目前制備PRP的常用方法。劉彩霞等[6]比較了動物模型中不同離心力和離心時間所制備的PRP對牽張成骨的影響，結(jié)果顯示應(yīng)用Landesberg法以兩次離心(每次200 × g、離心10 min)法制作的PRP血小板計數(shù)明顯高于全血，為全血的6.17 倍;血小板回收率超過86%，促進新骨生成的作用較明顯。離心力> 250 × g時會導(dǎo)致血小板破壞過多，而一次離心時間< 5 min得到的PRP血小板濃度與全血無明顯差異[7]。Marx[2]等在制作PRP時發(fā)現(xiàn)，先進行高速離心，1次離心后界面以下2mm的紅細胞層血小板濃度最高，棄去上清液后再次以低速離心，這樣可更好地提取血小板。但多數(shù)學(xué)者研究認為，采用改良Appel[8]法，即先以低速離心后吸取全部上清液、交界層下少部分紅細胞置于另一支離心管，然后高速離心，所得的血小板回收率較高。
富血小板血漿的作用機理
PRP的作用是通過生長因子的相互作用和相互調(diào)節(jié)下完成的, 生長因子分泌后立即黏附至靶細胞膜表面，激活細胞膜受體。這些膜受體再誘導(dǎo)出內(nèi)在的信號蛋白，激發(fā)細胞正常的基因序列表達。因此，PRP釋放的生長因子不進入靶細胞內(nèi)，不會導(dǎo)致靶細胞的遺傳性能發(fā)生改變，僅使正常愈合過程加快。雖所有參與組織修復(fù)與重建的細胞因子作用機制仍不明確[3]，但是細胞因子對組織修復(fù)與重建的部分作用已經(jīng)明確，如：PDGF是最早出現(xiàn)在骨折部位的生長因子之一, 可以刺激骨髓基質(zhì)細胞的有絲分裂,增加成骨細胞的數(shù)量; 刺激內(nèi)皮細胞的生長, 促進受植區(qū)的毛細血管的生成; 還可以刺激單核巨噬細胞的趨化。作為一種促進有絲分裂和生物趨化因子, 可以在創(chuàng)傷骨組織中高度表達, 促進成骨細胞的趨化、增殖, 并增加膠原蛋白合成的能力[ 9] ;TGF-β以旁分泌和/或自分泌的方式作用于成纖維細胞、骨髓干細胞、成骨前體細胞和破骨細胞, 刺激成骨前體細胞及成骨細胞的趨化、有絲分裂及膠原纖維的合成, 抑制破骨細胞的形成和骨吸收, 在骨折修復(fù)中具有極為重要的作用[ 10] ;IGF促進成骨細胞的增生和遷移作用, 提高成骨細胞活力 ; VEGF可誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞增殖遷移從而促進新生血管形成等[11]。另外，激活的PLT同時釋放大量蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)對組織再生均有重要意義。凝血酶可以募集周圍組織血管內(nèi)皮細胞，增強其活力，人體臍靜脈三維培養(yǎng)條件下，凝血酶可刺激成纖維細胞增殖及新生毛細血管形成，同時可誘導(dǎo)負反饋，從而限制新生毛細血管合成[12]。纖維蛋白刺激角化細胞遷移，實現(xiàn)細胞和細胞間的相互作用，對細胞形態(tài)恢復(fù)具有重要意義[13]。
3 PRP 在骨科領(lǐng)域的應(yīng)用
3.1 骨缺損修復(fù)
骨缺損的修復(fù)一直是骨科臨床所面臨的難點之一, 目前對骨缺損修復(fù)的方法主要有自體骨移植、同種異體骨移植、生物材料填充、組織工程技術(shù)、基因治療等。自體骨移植時雖可以取得滿意的療效,但骨來源有限, 且取骨不僅需要額外的手術(shù)操作,還增加患者痛苦, 同時還會引起多種術(shù)后并發(fā)癥及附加損傷。組織工程學(xué)的創(chuàng)立和發(fā)展為骨缺損的修復(fù)提供了新的思路和方法。復(fù)合成骨細胞和/或生長因子的生物材料具有良好的骨誘導(dǎo)性，在修復(fù)骨缺損中具有良好的應(yīng)用前景。但是生長因子大多于體外制備，且多為單一因子，制備復(fù)雜，價格昂貴。Assoian [ 14] 首先發(fā)現(xiàn)了血漿中提取的PRP中含有多種生長因子, 為骨缺損的修復(fù)提供了廣泛的應(yīng)用前景。Marx[ 2 ]最早應(yīng)用PRP進行骨缺損修復(fù)的臨床研究，其研究結(jié)果表明, PRP復(fù)合移植骨修復(fù)速度比單用移植骨修復(fù)速度快1.162倍至2.116倍, PRP組移植骨密度(74.0% ±11% )明顯高于對照組(55.1% ±8% )。Fu jimori等[ 15]將自體骨復(fù)合PRP用于兔脛骨缺損, 研究發(fā)現(xiàn)PRP不僅加快新骨形成, 同時提高新生骨質(zhì)量。Kovacs等[16] 在犬下頜骨缺損修復(fù)研究中發(fā)現(xiàn)通過骨密度評價和組織學(xué)評價, 復(fù)合PRP的生物材料組均優(yōu)于單純使用生物材料組, 認為PRP對骨缺損有修復(fù)作用。
3.2 脊柱融合方面的應(yīng)用
PRP的研究為脊柱融合開辟了一條新途徑, 它解決了自體骨來源有限, 異體骨免疫排斥反應(yīng), 生物材料無骨誘導(dǎo)活性, 單一生長因子制作復(fù)雜、價格昂貴等缺陷, 明顯促進成骨作用, 加速骨愈合能力, 提高脊柱融合率, 促進患者術(shù)后病情恢復(fù)及生活質(zhì)量的提高。但目前PRP在脊柱融合方面尚處于研究階段, 相關(guān)報道有限。Lowery等[ 17]證實PRP能夠早期促進骨融合, 在臨床上應(yīng)用于腰椎融合時產(chǎn)生良好的效果。Hee 等[18] 報道，自體髂骨復(fù)合生長因子早期骨融合率高于單純自體髂骨植骨，23例應(yīng)用自體髂骨復(fù)合PRP 患者中，術(shù)后4 個月及6 個月X 線評價融合率為70% 及96%，而自體髂骨移植患者中分別為36% 及94%，術(shù)后24 個月，兩組間無明顯差異，分別為96% 和94%。Castro 等[19]在腰椎間孔入路腰椎椎間植骨融合術(shù)研究中發(fā)現(xiàn)，復(fù)合PRP組融合率低于對照組19%，分析原因可能與腰椎生物力學(xué)環(huán)境、制備PRP的技術(shù)、PLT數(shù)量、功能以及生長因子濃度有關(guān)。
3.3 半月板關(guān)節(jié)軟骨損傷與修復(fù)
通常，受損的關(guān)節(jié)軟骨本身只有很弱的再生修復(fù)能力[20]，如何對受損的關(guān)節(jié)軟骨進行修復(fù)、恢復(fù)關(guān)節(jié)面完整性、重建關(guān)節(jié)功能和防止關(guān)節(jié)退變是再生醫(yī)學(xué)的研究熱點。動物實驗及臨床應(yīng)用均表明PRP 具有促進損傷軟骨組織修復(fù)的功能。Cugat 等[21]在兔全層軟骨損傷模型中，首次應(yīng)用局部注射自體PRP，發(fā)現(xiàn)軟骨的生物力學(xué)行為明顯改善，軟骨細胞增殖，軟骨損傷明顯修復(fù)。Kon等[22]最近報道關(guān)節(jié)內(nèi)注射PRP治療100例患有慢性膝關(guān)節(jié)軟骨退行性疾病患者(每次注射PRP 5 ml，21天注射3次為一療程)，注射后注射口無菌包扎并囑患者屈伸膝關(guān)節(jié)數(shù)次，術(shù)前和術(shù)后應(yīng)用患者自評總體健康狀況視覺類比量表(EQ-VAS)和國際膝關(guān)節(jié)評分委員會(IKDC )主觀和客觀評估表進行臨床評分，結(jié)果顯示治療2個月、6個月和12個月后臨床各項評分均較術(shù)前顯著提高。Everts 等[23] 在單側(cè)全膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)后應(yīng)用PRP，隨訪5個月，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用PRP后關(guān)節(jié)纖維化程度較對照組明顯減輕，關(guān)節(jié)活動范圍明顯好。Mitsuyama 等[24] 研究了PRP對人類軟骨細胞的作用，10 位參與試驗的志愿者分別提供全血和膝關(guān)節(jié)軟骨組織，用于制作PRP和提取軟骨細胞，將提取出的軟骨細胞分別以不同濃度的PRP處理，觀測其增殖情況。10 天后觀測結(jié)果顯示，30% 的PRP能顯著促進人軟骨細胞的增殖，細胞增殖不僅受PRP影響，而且與PRP濃度的增加成正相關(guān)。如上所述，PRP可以作為修復(fù)軟骨時的一種治療選擇
3.4 修復(fù)韌帶/ 肌腱損傷
肌腱組織由腱細胞、纖維膠原蛋白和水分構(gòu)成，自身缺乏血液供應(yīng)，故受損后的愈合速度慢于其他結(jié)締組織。隨著研究深入，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)生長因子在韌帶修復(fù)過程中起到至關(guān)重要的作用，進而嘗試利用PRP來促進或輔助治療肌腱損傷。Anitua 等[25]將PRP與人肌腱細胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，隨著肌腱細胞的增殖，培養(yǎng)基中VEGF及肝細胞生長因子(HGF)也相應(yīng)增加，而VEGF具有促進血管形成的作用，HGF具有抗纖維化作用，減少瘢痕形成。臨床應(yīng)用PRP治療韌帶/ 肌腱損傷取得滿意療效。Sánchez等[26]收治12例跟腱撕裂患者，其中6 例作為試驗組在手術(shù)同時進行PRP 輔助治療，6 例作為對照組只進行手術(shù)治療。結(jié)果顯示試驗組患者恢復(fù)活動范圍較對照組早，且未發(fā)生相關(guān)并發(fā)癥，Mishra等[27]應(yīng)用超聲引導(dǎo)使用PRP治療慢性肘部肌腱疾病取得滿意療效。140例患者均首先給予理療及其他非手術(shù)治療，20例患者疼痛無好轉(zhuǎn)，其中15 例經(jīng)皮下注射PRP，對照組5 例注射布比卡因，隨訪皮下注射PRP 患者中，8 周后60% 患者疼痛緩解，6 個月后81% 患者疼痛緩解，25.6 個月后93% 疼痛緩解并且能在更短時間內(nèi)恢復(fù)訓(xùn)練活動
3.5 預(yù)防骨與關(guān)節(jié)感染
骨與關(guān)節(jié)感染是骨科手術(shù)面臨的難題之一，常用預(yù)防方法是在圍手術(shù)期應(yīng)用抗生素[28]。但長期大量應(yīng)用抗生素不僅帶來各種系統(tǒng)副作用，還會導(dǎo)致耐藥菌株的出現(xiàn)[29]。因此，有必要探索一種新的解決骨感染問題的方法。PRP由于其含有的高濃度血小板可以釋放大量生長因子，當(dāng)PRP被凝血酶激活后形成血小板-白細胞凝膠(PLG)，其中含有高濃度的血小板和白細胞，這些細胞成分在機體先天免疫防御反應(yīng)中發(fā)揮著趨化、吞噬和氧化殺菌等重要作用[30] 。此外，血小板還可釋放大量生長因子促進被炎癥破壞的組織細胞再生，為炎癥消退提供良好的局部微環(huán)境。PRP的這種多重特性使其具有傳統(tǒng)抗生素所不具備的優(yōu)勢。因此，作為一種“生物抗菌制劑”，PRP為我們預(yù)防和治療骨感染提供了一種新的思路。Bielecki 等[31] 通過紙片擴散法研究發(fā)現(xiàn)，PLG在體外可以抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的生長。Moojen 等[32] 也報道了PLG在體外具有抑制金黃色葡萄球菌生長的作用。此外，一些臨床研究表明PLG可降低外科手術(shù)后的出血和感染發(fā)生率[33-34]。PLG在體外不僅可以抑制金黃色葡萄球菌的生長，而且在體內(nèi)局部應(yīng)用還可以抑制細菌生長，還可以協(xié)同機體免疫防御系統(tǒng)殺滅細菌，從而預(yù)防骨與關(guān)節(jié)感染的發(fā)生。
4 展望
采用生物的方法解決生物和醫(yī)學(xué)問題是目前研究組織修復(fù)的熱點。PRP完全是自體的, 無疾病傳染及免疫排斥反應(yīng), 從根本上解決了傳播疾病的危險及骨組織工程學(xué)一直面臨的移植物難以存活的難題; PRP中含有多種高濃度的生長因子, 各生長因子的比例與體內(nèi)正常比例相似, 并具有最佳的協(xié)同作用, 既有單一因子的生物學(xué)效應(yīng), 又有各種生長因子之間的相互作用。這在一定程度上彌補了單一生長因子刺激成骨效果不佳的缺點, 滿足了早期骨愈合所需生長因子的需要; PRP有促凝血的作用, 可刺激軟組織再生, 促進傷口早期愈合; PRP中所含的生長因子不進入細胞內(nèi)或細胞核內(nèi),使正常的愈合過程加速, 無致畸作用, 也不具有誘導(dǎo)腫瘤形成的能力; PRP制作簡單且對患者的損傷小, 只需從患者的靜脈取血即可制作PRP, 國外已有專門制作PRP的儀器, 操作簡便并且所需時間短。因此, PRP是一種安全的、簡便的、廉價的可用于骨科的各個治療領(lǐng)域，應(yīng)用前景廣泛。
但PRP用于臨床尤其是在骨科領(lǐng)域仍有許多尚未解決的問題，如PRP制備無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，不同方法制備的PRP生長因子濃度差異大，PRP所含生長因子數(shù)量及其生長因子的相互作用機制仍不明確等。因此對PRP研究首先要建立一套高效穩(wěn)定、對PLT破壞小、純度高而穩(wěn)定的PRP制備方法; 其次在應(yīng)用PRP時盡量避免影響PRP療效的因素; 選擇適當(dāng)?shù)妮d體使PRP 與載體結(jié)合以提高PRP骨再生能力, 建立動物模型, 設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)化的試驗, 為PRP的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。
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